Labraprojekti: Brettanomycesin eristäminen soluviljelyllä

IMG_20180918_211434-01.jpeg

Muutama viikko sitten sain eräältä kotipanijalta käymisastian pohjalle jääneen hiivamassan eli ”kakun”, joka koostui tuntemattomaksi jääneestä oluthiivakannasta (saccharomyces cerevisiae) sekä The Yeast Bayn Amalgamation Brett Super Blend -brettasekoituksesta. Tämä sekoitus puolestaan sisältää kuusi eri brettanomyces-hiivakantaa. Bretta tunnetaan oluenpanijoiden keskuudessa maanläheisistä aromeistaan ja sen avulla pantuja oluita kuvaillaan tallisiksi, navettaisiksi ja multaisiksi. Tässä kirjoituksessa kerron yrityksestäni eristää puhdas brettakanta saamastani hiivamassasta myöhempää käyttöä varten. Tarkoitus olisi myöhemmin panna brettasaison (ja niin teinkin), jossa mukana olisi bretan lisäksi jokin saisonhiiva.

Soluviljelmien tekeminen vaatii hieman lisävälineitä tavallisten oluenpanovermeiden lisäksi, mutta ei mahdottomia hankintoja. Välineiden sterilointi onnistuu parhaiten painekattilassa. Kunnollisesta mikroskoopista on apua, mutta näitä labratekniikoita voi soveltaa, vaikkei sellaista olisikaan. Muut tarvikkeet voi tilata muutamalla kympillä Kiinasta.

Puhtaus on solujen kasvattelussa vieläkin olennaisempaa kuin panemisessa. Muutama ylimääräinen mikrobi ei pilaa oluterää, mutta yksikin homeitiö voi tehdä soluviljelmästä käyttökelvottoman. Pelkkä desinfiointi (lähes kaikkien solujen tuhoaminen) ei enää riitä, vaan välineet ja kasvatusnesteet pitää steriloida.

IMG_20180606_204111.jpg
Tältäkö ne brettaoluet maistuu?

Labratakki päälle ja kumihanskat käteen!

Alkuperäinen suunnitelmani oli:

  1. Eristä hiivakakusta useita yksittäisiä soluja ja kasvata näistä solupesäkkeitä.
  2. Tunnista näistä useampi brettapesäke ja käytä kullakin pieni määrä olutta.
  3. Valitse parhaan maun tuottava kanta.
  4. ???
  5. Profit.

Aluksi tein pari kasvatusalustaa petrimaljoille (ohje alla). Olin ottanu saamastani mikrobimassasta talteen parisataa millilitraa steriiliin kasvatuspulloon. Otin tästä pullosta steriloidulla viljelysilmukalla soluja ja sivelin ne kasvatusalustalle (eli pleittasin solut, niin kuin ammattilaiset sanovat, ohje alla).

Omilla laitteillani en pysty erottamaan eri brettakantoja toisistaan, mutta uskoin pystyväni mikroskoopilla erottelemaan brettasolut oluthiivasta ja bakteereista. Bakteerisolut ovat huomattavasti hiivoja pienempiä, ja näkemieni kuvien perusteella brettasolut puolestaan eroavat saccharomycesistä pitkulaisen muotonsa takia.

img_20180923_153137.jpg

Parin päivän päästä maljalla alkoi näkymään yksittäisiä solupesäkkeitä. Bretan ja oluthiivan erottaminen ei kuitenkaan ollutkaan niin helppoa kuin olin kuvitellut, sillä kaikki solut näyttivät mikroskoopin läpi hyvin samanlaisilta. Ehkä joku kokeneempi olisi tässä onnistunut. Muutaman päivän päästä maljalla kuitenkin kasvoi selvästi kahden kokoisia pesäkkeitä (ks. kuva), joten päättelin, että pienemmät ovat luultavasti brettaa ja nopeammin kasvaneet oluthiivaa. Tämä päätelmä perustui siihen, että oluessakin brettakin toimii oluthiivaa hitaammin ja toisaalta aiemmin maljoilla kasvattaneeni oluthiivat ovat kasvaneet aika rivakkaa tahtia.

IMG_20180927_174428.jpg

Poimin silmukalla kahdeksan pienempää pesäkettä ja pleittasin ne pienemmille maljoille, jotta saisin kokonaan yhdestä solusta kasvaneita kantoja. Tässä vaiheessa alkoi selvästi tapahtua, koska näiden kahdeksan maljan viljelmät alkoivat nopeasti näyttää erilaisilta. Neljässä solumassan pinta oli selvästi mattapintainen, pari viljelmää kasvoi todella hitaasti, yksi luultavasti kontaminoitui nopeammin kasvavalla solukannalla (oluthiivalla?) ja yksi kasvoi hitaasti, mutta näytti muuten kiiltäväpintaiselta oluthiivalta. Otin näistä soluja ja siirsin 10 eri koeputkeen, joihin olin valmistanut steriiliä vierrettä mallasuutteesta.

Muutaman päivän päästä putkissa alkoi näkyä aktiivisuutta ja niihin alkoi kertyä käymisen seurauksena painetta. Päästin joka päivä niistä vähän kaasua pois löysäämällä pikaisesti korkkeja.

IMG_20181003_212956.jpg

Noin viikon jälkeen ”oluet” alkoivat kirkastua ja pohjalla alkoi näkyä selvä hiivakakku. Otin jokaisesta putkesta pienen olutnäytteen steriilillä pipetillä ja maistoin. Tässä vaiheessa tuli sellainen olo, että tämä projektihan saattaa jopa onnistua. Yhtä putkea lukuunottamatta kaikki näytteet maistuivat brettaiselta oluelta. Putki 8 maistui makealta ja pilaantuneelta, minkä tulkitsin merkiksi siitä, että se ei ollut lähtenyt kunnolla käymään ja oli mahdollisesti kontaminoitunut. Muissa putkissa oli havaittavissa 3-4 selkeästi erilaista makumaailmaa. Parissa putkessa oli vahva soijakastikkeen maku ja tanniininen karheus, yksi maistui nahkavyöltä ja kolalta ja muutamassa oli hevostallia ja hieman soijakastiketta.

Tässä vaiheessa jäi enää tehtäväksi parhaan kannan tai kantojen valitseminen ja käyttökelpoisen solumäärän kasvattaminen.

Kasvatusalustojen tekeminen

Välineet: painekattila, kannellisia petrimaljoja, mallasuutetta, hiivauutetta, glukoosia (panimosokeria), agarjauhetta, alumiinifoliota, pieni mittalasi tai Erlenmeyerpullo, vaaka (0,1 g tarkkuus suositeltava)

Mittaa lasiin 100 ml vettä ja lisää

  • 2,0 g mallasuutetta
  • 1,0 g hiivauutetta
  • 2,0 g glukoosia
  • 1,5 g agarjauhetta.

Peitä lasi alumiinifoliolla ja laita painekattilaan vesihauteeseen. Keitä painekattilassa 15 min ajan, jotta seos steriloituu. Anna painekattilan jäähtyä.

IMG_20180918_190545.jpg
Kasvatusliemi ja petrimaljat menossa steriloitaviksi.

Huom! Älä vapauta painetta nopeasti! Paineen laskiessa äkisti seos voi alkaa kiehua ulos astiasta.

IMG_20180918_194239_2-01.jpeg

Ota lasi ulos painekattilasta ja anna jäähtyä. Valmistaudu kaatamaan seos petrimaljoihin, kun se on noin 50-asteista. Hyvä hetki on, kun lasi tuntuu kuumalta, muttei polttavalta. Työskentele puhtaassa ympäristössä, jossa ei ole ilmavirtauksia, jotka voisivat tuoda mukanaan ei-toivottuja mikrobeja. Raota petrimaljan kantta ja kaada seosta nopeasti maljalle. Paras määrä on sen verran, että maljan pohja juuri ja juuri peittyy. Sulje maljan kansi heti kaatamisen jälkeen. Anna jäähtyä ja kiinteytyä.

Huom! Jos käytettävissäsi ei ole painekattilaa, seoksen voi yrittää desinfioida kiehuvassa vesihauteessa, mutta tällöin aikaa kannattaa pidentää. Suurin osa mikrobeista tuhoutuu 100 asteen lämpötilassa, mutta pelkkä keitto ei kuitenkaan takaa seoksen steriiliyttä.

Maljat säilyvät puhtaissa oloissa hyvin. Riippuen säilytysolosuhteista, jossain vaiheessa niihin luultavasti pääsee ilmavirtausten mukana ei-toivottuja mikrobeja ja niihin alkaa kasvaa hometta. Soluviljelmät kannattaa tehdä mahdollisimman pian kasvatusalustan tekemisen jälkeen.

Solujen pleittaus

Välineet: kasvatusalusta, kaasupoltin, viljelysilmukka (tai pätkä ohutta rautalankaa)

Steriloi silmukka kuumentamalla se kaasupolttimella hehkuvaksi. Upota silmukka hiivan tai nesteen sekaan lyhyesti. Sivele silmukalla kasvatusalustan pintaa seuraavan kuvion mukaisesti:

  1. maljakuvaSivele kolme suoraa yhdelle reunalle.
  2. Käännä maljaa n. 45 astetta, steriloi silmukka ja sivele taas kolme suoraa niin, että ne leikkaavat aiemmin tekemäsi suorat.
  3. Käännä vielä uudestaan n. 45 astetta ja sivele taas kolme suoraa, jotka leikkaavat aiemmat suorasi.
  4. Lopuksi sivele vielä yksi mutkitteleva ura, joka leikkaa viimeiset kolme suoraasi.
  5. Steriloi lopuksi silmukka.

Näin solujen määrä eri suorilla vähenee ja viimeistään viimeiselle uralle jää luultavasti yksittäisiä soluja kauas toisistaan. Näin saat maljalle yksittäisiä, erillisiä solupesäkkeitä.

Anna kasvaa huoneenlämmössä tai hieman lämpimässä (maks. 35 °C), kunnes erillisiä pesäkkeitä alkaa näkyä. Valmiit viljelmät voi säilöä jääkaapissa muutaman kuukauden ajan. Tällöin maljan reuna kannattaa teipata sähköteipillä kosteuden haihtumisen ja kontaminaatioiden estämiseksi. Jos haluat säilyttää hiivakantoja pitempään, voit säilöä ne pakastimessa glyseroliin sekoitettuna.

IMG_20180918_202915.jpg

IMG_20180918_203045.jpg

IMG_20180918_204756.jpg
Kuvaaja: Sandra Luhtaniemi

 

Vastaa

Täytä tietosi alle tai klikkaa kuvaketta kirjautuaksesi sisään:

WordPress.com-logo

Olet kommentoimassa WordPress.com -tilin nimissä. Log Out /  Muuta )

Google photo

Olet kommentoimassa Google -tilin nimissä. Log Out /  Muuta )

Twitter-kuva

Olet kommentoimassa Twitter -tilin nimissä. Log Out /  Muuta )

Facebook-kuva

Olet kommentoimassa Facebook -tilin nimissä. Log Out /  Muuta )

Muodostetaan yhteyttä palveluun %s